Метод выявления активности фосфоглюкомутазы

Метод выявления активности фосфоглюкомутазы

Фильтровальная бумага для внесения проб: Ватман № 3 или Шлейхер и Шюлль № 598. Электрофорез проводят при градиенте напряжения 5— 5,5 В/см-1 в течение 16—17 ч в условиях холодильника. Метод выявления активности фосфоглюкомутазы (способ агаровой аппликации): готовят 0,1 М трис-HCl буфер, pH 8,0 (12,1 г триса, 3,7 г ЭДТА, 26,8 мл 2 N НС1 и 10 мл 1 М раствора хлористого магния доводят до 1000 мл дистиллированной водой), берут 20 мл этого буфера, добавляют к нему 100 мг растворимого агара и кипятят на водяной бане в течение 30 мин до полного растворения и расплавления агара. После охлаждения агарового раствора до 40 °С в него добавляют: 25 мг глюкозо-1-фосфата (Г-1-Ф), 2 мг никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH), 2 мг феназинметосульфата (ФМС), 2 мг 3(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолиевого бромида (МТТ) и 0,35 ЕД глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФД). При использовании Г-1-Ф (марки «Чда») в агаровый раствор необходимо ввести следовые количества непосредственного субстрата для фосфоглюкомутазы — глюкозо-1,6-дифосфата. При использовании Г-1-Ф (марки «Чда») в агаровый раствор необходимо ввести следовые количества непосредственного субстрата для фосфоглюкомутазы — глюкозо-1,6-дифосфата. Время инкубации крахмального геля с агаровой аппликацией 60—90 мин в условиях термостата при 37 °С. Принцип выявления активности фосфоглюкомутазы: фосфоглюкомутаза переводит глюкозо-1-фосфат в присутствии глюкозо-1,6-дифосфата в глюкозоб-фосфат, который под воздействием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и в результате редукции NADP переходит в 6-фосфоглюконат.

Восстановленный (редуцированный) NADPH2 в присутствии феназинметасульфата переводит тиазолиевый МТТ в нерастворимые гранулы фиолетового формазана, который выпадает в местах проявления ферментативной активности фосфоглюкомутазы, окрашивая ее электрофоретически разделенные групповые изоферменты.

1 звезда2 звезды3 звезды4 звезды5 звезд (Еще не оценили)
Загрузка ... Загрузка ...

Оставить комментарий

Почта (не публикуется) Обязательные поля помечены *

Вы можете использовать эти HTML теги и атрибуты: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <strike> <strong>

Подтвердите, что Вы не бот — выберите человечка с поднятой рукой: